SCI搬运工 | 生物膜基质中的微处理成像技术有哪些？

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生物膜广泛存在于废水处理系统，天然水体和受感染的生物组织中，对许多领域都很重要。控制生物膜的形成和生长，以及探测生物膜中基质的生命周期，对于控制水污染，防止生物污染和治疗生物膜相关感染至关重要。解决这些问题需要对生物膜微观环境中的化学和生物化学过程进行深入分析。然而，高度水合的生物膜，复杂的微生物物种和变化的环境使得表征变得困难。此外，生物膜相关感染中的细菌通常是不可培养的;因此，体内表征技术对于未培养的微生物也是必需的。

最近基于相互作用力，分子振动模式，软X射线吸附，荧光激发，电离和表面等离子共振（SPR）研发出了灵敏，独特、快速的成像模式，以绘制形态结构和材料分布并探索生物膜基质中的微观过程。在这篇综述中，我们描述了这些成像技术在表征生物膜基质中的原理和进展，并讨论了这些方法在描述不同微观过程中的优势，适用性和局限性。

1. 生物膜基质中微观过程成像技术

稳定的生物膜结构和功能对于去除污染物是必不可少的，而必须避免在组织，医疗器械和膜分离装置的表面上形成生物膜。使用合适的成像技术来表征生物膜基质中的各种微观过程有助于确定环境污染物的去除机制并阐明生物膜感染过程和治疗计划。这些方法可根据其分析性能和适当的使用场合进行选择。

不同的技术展示了不同的空间分辨率，时间分辨率和穿透深度，并且可以显示生物膜微观过程中目标分析物的动态分布。

不同成像技术的原理图和代表性图像

(请参见下文图例.)

图1.（A）用于分析ATP膜蛋白相互作用的地形和识别成像（TREC）：示意图（i）、地形模式（ii）和识别模式（iii）[3].（B）扫描透射X射线显微镜（STXM）：示意图（i）[4].生物膜（ii）中的硒（红色）、蛋白质（蓝色）和多糖（绿色）的STXM图像，以及STXM图像（iii）[5]中红色区域中靠近硒锂边缘结构的X射线吸收。（C）质谱成像（MSI）：Shewanella oneidensis MR-1生物膜（i）的荧光二次离子质谱分析示意图，m/z-范围为0至270（ii）的负SIMS光谱，以及与之相关的s.oneidensis MR-1生物膜（iii）的棕榈酸二维图像[6]。（D）共焦激光扫描显微镜（CLSM）：示意图（i）[2]。三维图像Z-堆栈显示生物膜（II）中大肠杆菌（红色）和三甲基铵末端量子点（绿色）的分布，三甲基铵末端量子点（III）的水平分布[7]。（E）表面等离子体共振成像（SPRI）：示意图（i）、LiCoO2纳米粒子图像（ii）和SPR强度曲线（iii）[8]。（F）拉曼散射成像：示意图（i），紫外色杆菌菌落的表面增强拉曼光谱（ii），以及单一培养（iii）中绿脓菌素（544cm-1）的表面增强拉曼光谱图[9]。（G）傅立叶变换红外（FTIR）光谱显微镜成像：微流体（I）示意图，选定位置的FTIR光谱（II），以及~1310 cm-1处的二维FTIR图像（蛋白质酰胺III）（III）[10]。水平轴和垂直轴分别代表时间和空间分辨率。每个子图左上角的红色框架定位其坐标。经许可，根据指定参考改编的图像。

生物膜基质成像技术

地形与识别成像

基于原子力显微镜（AFM）的分子识别成像技术已经被研发出来，可以绘制两个分子之间的特定相互作用，同时可以生成地形和识别成像（TREC）图像。使用特定的化学基团或配体功能化的AFM尖端，用于探测与基质中其他分子的特定相互作用并成像。硅烷化和金-硫醇化学分别是常用于功能化硅/氮化硅和金尖端的方法。TREC可以通过使用不同的完整性分子作为AFM尖端上的识别头来确定多个分析物；这些识别头可以独立、特定地识别和成像它们各自的同源物。TREC的一个潜在应用是同时揭示生物膜基质中细胞内和细胞外结合事件（如药物结合、抗体-抗原、抗生物膜材料等）的形貌特点并进行多功能识别成像。

红外光谱显微镜成像

傅立叶变换红外（FTIR）光谱显微术成像是一种用于可视化样品中化学键的空间分布的技术；它用于分析生物膜基质而无需标记。然而，生物膜或培养基中的水在红外光谱的酰胺I波段有很强的吸收；减少水干扰的方法包括应用衰减的全降低水干扰的方法包括应用减弱的全反射 -  FTIR成像以及使用封闭或开放通道微流体细胞进行生物膜培养。基于同步辐射的FTIR（SR-FTIR）光谱显微镜以其超高的亮度和更高的空间分辨率在环境领域得到了广泛的应用。SR-FTIR成像可以表征生物膜的物理特性和生物膜与基质的相互作用。最近，一种突然兴起的技术，基于AFM的红外（AFM-IR）被证明能够在AFM的空间分辨率下提供红外成像，并有助于进一步了解生物膜微观过程。

拉曼光谱成像

拉曼成像被广泛用于确定生物膜的形态和生化成分。拉曼光谱通过探测入射激光的非弹性散射（拉曼散射），提供有关分子振动、旋转和其他低频化学键模式的信息。拉曼化学成像提供了一种无标记、非破坏性和非侵入性的技术，可以同时显示生物膜的化学成分和分子结构。拉曼光谱的灵敏度通常受到限制，但可以通过表面增强拉曼散射（SERS）、尖端增强拉曼散射（TERS）、相干拉曼散射（CRS）和共振拉曼散射（RRS）来增强。

扫描透射X射线显微镜

扫描透射X射线显微镜（STXM）结合X射线吸收近边缘结构（XANES），是一种强大的工具，可以应用于水合生物膜，因为软X射线可以穿透水和软X中合适的分析核心边缘射线区域。XANES敏感地揭示了存在的特定元素的化学信息，例如化学键，电荷态和磁状态。配备同步辐射光源的X射线吸收结构缩短了测试时间并提高了信噪比。STXM提供了具有高空间分辨率（优于数十nm）和高化学状态分辨率的“真实世界”样品，可实现各种碳物质的成分映射，如蛋白质，多糖，脂类，核酸和其他元素在不需添加探针的情况下在生物膜中的分布。

共焦激光扫描显微镜

与传统光学显微镜或荧光显微镜相比，共焦激光显微镜（CLSM）使用基于荧光显微拷贝成像的激光源和扫描装置，并应用基于传统光学显微镜的共轭聚焦装置实现逐层扫描和样品成像。使用荧光探针标签获取样品的荧光图像，包括特定成分。CLSM提供高灵敏度、光学切片和无损分析，主要应用于生物膜的三维结构图绘制和定量细胞外蛋白质、多糖、脂类、核酸和其他分子的分布。

质谱成像

质谱成像（MSI）是一种强大的化学绘图技术，可以提供活体生物膜的元素，同位素和分子表征。该技术不需要荧光或同位素标记，并且可以灵敏地（ppm-ppt）同时成像数千个分子。最近，已研发出多种电离方法，如基质辅助激光解吸/电离（MALDI），解吸电喷雾电离（DESI），纳米粒子激光解吸/电离（纳米LDI）和二次离子质谱（SIMS）。使用MSI技术，其成像特性如表1所示。其中，MALDI和SIMS是非环境方法中采用和电离最广泛的模式。此外，SIMS可以通过重建连续切片的2D MSI分析来绘制3D图像，并且采集时间需要几个小时。为了获得更高的分辨率并揭示有关生物膜的更多信息，MSI可以与其他技术结合使用。SIMS和荧光原位杂交（FISH）的组合可以分析微生物群落动态和特定物种的代谢。此外，超分辨率荧光显微镜和液体飞行时间（ToF）SIMS之间的相关成像可以以亚微米分辨率绘制实时生物膜EPS 。

表面等离子体共振成像

表面等离子体共振成像（SPRI）可用于描述生物膜的独特特征，包括小分子和微生物细胞。当入射光激发金属和电介质界面中的自由电子时，表面等离子体波形成并平行于金属表面传播。穿透金属的入射光会产生挥发性波。耦合表面等离子体和消逝波产生SPR。SPR偏移对金属表面的折射率或质量密度超敏感至200-300nm的深度。因此，可以实时监测金属表面的反应。SPRI基于通过电荷耦合器件（CCD）相机对分布在整个生物芯片上的SPR信号进行可视化，该相机用于实时且无标签地研究微生物细胞生理学。在这种情况下，强度SPRI被广泛应用;通过CCD相机收集对应于感测表面上的折射率分布的反射光并将其转换成2D强度对比图像。

2. 生物膜微观过程

膜的形成

所有上述技术可通过确定生物膜形成期间的形态变化来表征生物膜形成。SPRI可以监测微生物的附着和分离，生物膜生长和EPS分泌，这可用于估计抗菌药物的活性和开发抗菌膜材料。但是，其分析深度仅为200-300 nm。此外，SPRI仅适用于体外研究，因为生物膜必须在传感器表面培养。

TREC可以在微生物附着和病原体感染期间量化细胞表面上的特异性和非特异性结合受体。使用单一细菌或病毒功能化AFM提示可以探测细胞 - 细胞和细胞 - 基质的相互作用，以确定生物膜的内聚强度。然而，在AFM尖端功能化后，配体（分子，细胞和病毒）的粘附活性可能受到影响。

CLSM广泛应用于观察生物膜形成和生长过程中的微观过程。例如，氧化还原敏感的荧光蛋白（roGFP）融合到表面蛋白（BpfA）可用于量化生物膜基质中的深度分辨氧化还原状态。CLSM可以通过使用相关的商业试剂盒标记来表征生物膜的pH梯度，代谢和酶活性。此外，两亲性荧光碳点适合于在不同环境条件下的EPS成像。CLSM可以确定生物膜的生理状态并估计生物膜的感染过程和药物效应。然而，由于需要荧光标记，该方法不能同时对所有生物膜基质的成分进行成像。

MSI提供对生物膜形成，功能和调节的深入分析。可以通过对它们的空间分布的成像来揭示粘合剂相关的生物分子。MSI还可以揭示生物膜形成和发育过程中基因表达的异质性。基于激光烧蚀电喷雾电离技术的MSI也可以对在不同环境条件下生长的生物膜的众多代谢物成像。因此，MSI可用于开发生物膜控制策略。但是，MALDI和SIMS需要样品干燥和切片，MSI测量是在真空下进行的;因此，获得的生物膜不是实际目标。DESI可以在环境温度和压力条件下原位分析生物膜，但其空间分辨率需要提高。

图2.生物膜基质中的典型微观过程和相应的成像技术。（A）生物膜的形成：表面等离子共振成像（SPRI）揭示微生物的附着和分离;地形和识别成像（TREC）映射细胞表面的粘附位点;共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和质谱成像（MSI）确定生物膜的生理和代谢;拉曼和傅立叶变换红外（FTIR）显示生物膜相关的膜污染。（B）污染物的去除：FTIR，STXM和CLSM绘制污染物分布和生物膜吸附;拉曼和MSI对生物膜中的污染物的生物转化进行成像。（C）细胞间信息传递：MSI和拉曼探究其内部特异性和种间关系。（D）药物的吸收：TREC检测生物膜上的药物受体;拉曼和CLSM观察生物膜基质中的药物转移。（E）细胞外电子转移：拉曼和MSI图谱介导电子转移中的分子。（F）对环境压力的反应：MSI识别反应蛋白;和SPRI监控EPS的产生。

拉曼可以识别一些病原体，但数据分析很复杂。此外，正常的拉曼成像是非常耗时的，这不适合于需要高时间分辨率的样品。SRS可以快速区分膜污染层的化学成分和图像3D空间分布。它提供了依据污垢层的成分和范围研发防污材料的证据。然而，与普通拉曼相比，SRS的高强度脉冲激光可能会损坏生物膜样品。

SR-FTIR成像可以映射生物膜的结构和生化组成的变化，例如EPS动态图，微生物分布，代谢中间体和生物膜引起的膜污染。但是，IR波段之间的任何重叠都需要进行去卷积。

污染物的去除

生物膜中的环境污染物通过生物吸附和生物转化去除。SR-FTIR可以通过扫描吸附后的新的或改变的吸附峰并结合到生物膜表面，来对生物膜中污染物（重金属，纳米材料和有机分子）的结合分布进行成像。与其他成像技术相比，它可以更容易地获得生物膜的污染物吸附特性。因此，如果污染物吸附不会产生吸收峰的新变化或变化，那么这种方法将是无效的。

CLSM-荧光探针可用于对生物膜基质中结合的环境污染物成像。由于rhodamine及其衍生物具有螺内酰胺结构的荧光特性，这些材料被广泛用作重金属选择性荧光探针的荧光触发剂。使用rhodamine B为荧光报告剂，以内酰胺为荧光开启开关，可在EPS和细菌表面获得Au³⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Cro4²⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Pd²⁺、三丁基锡和Zn²⁺的三维映射。溶剂依赖性荧光素 - 苯甲酰硫脲基探针也可以映射Ag⁺和Zn²⁺。这些结果表明CLSM可以确定生物膜中多种金属离子的结合特征并区分结合靶分子。CLSM还用于微生物聚集体中有机污染物和酶的分布的成像。但是，需要为不同的目标污染物制备不同的荧光探针。此外，荧光探针的分子重量有时会显著高于某些污染物的分子重量，这些污染物会显著干扰生物膜内污染物的迁移和吸附。

STXM可以方便地应用到同时利用金属吸收边缘信号映射生物膜基质中的金属形态，结合机制，和定量空间分布图，这有助于阐明生物膜中重金属的生物吸附机理。该技术还可以通过确定其化学价态来反映生物膜中基质的生物转化。许多金属和金属氧化物纳米粒子对生物膜具有细胞毒性，并且可以通过分析它们的吸附 - 溶解，形态和分布来追踪它们在生物膜中的生命周期。然而，STXM的分析深度通常<300 nm，较厚的生物膜需要专业技术进行切片处理。

MSI对于探测生物膜中环境污染物的生命周期非常有用。通过对代谢物进行成像可以阐明有机污染物的降解途径。最近，研发了一种用于液体真空界面（SALVI）的分析系统，该系统可以通过SIMS对生物膜进行原位成像。SALVI可以使用液体ToF SIMS对生物膜中的环境污染物（例如重金属）进行生物转化成像。因此，这些改进为污染物的去除机制的原位研究铺平了道路，尤其是生物膜中新出现的污染物。然而，SIMS的扫描范围和穿透深度限制在几微米，因此仅适用于薄生物膜。

拉曼通常与稳定同位素探测（例如，2H，13C和15N）标记的基质组合以研究它们的生物转化。例如，SERS结合15N稳定同位素探测可以在单细胞水平上区分微生物聚集体中的氮转化，为研究生物脱除镍过程中的硝化作用，氮化，脱氮和厌氧氨氧化提供了方法。因此，这种方法与FISH的结合可以更生动地反映细菌去除氮的过程中氮的转化。纳米级Au和Ag以及由纳米级Ag溶解的Ag⁺对细菌有毒，可能影响生物膜的功能。

细胞间信息传递

生物膜中微生物的相互作用是由营养物质，次生代谢物，无机元素和信号传感分子介导的。MSI广泛应用于捕获生物膜微生物信息沟通相关分子，包括种内和种间关系，以及细菌与受感染组织中宿主之间的相互作用。例如，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的共同感染经常发生在临床情况中;金属波动作为微生物群落结构的决定因素，通过对生物膜中的蛋白质和金属分布进行可视化来阐明。MALDI-ToF和MALDI-Fourier变换离子回旋共振MSI与MS / MS网络相结合，说明了不同种类之间在分子水平上的相互作用。这些关于中介机制的研究可以有助于控制生物膜的形成。通过扰乱微生物通讯可以抑制生物膜感染;相比之下，通过增强微生物通信以去除废水处理中的污染物，可以快速形成生物膜。然而，由于数据文件的大尺寸和高维度，MSI数据难以分析。

SERRS通过分析分泌的分子作为信号，如群体感应信号代谢物，为研究生物膜内的种内和种间信息传递提供了强有力的工具。因此，SERRS需要连续可调的激光器来调节具有不同信号分子的激光波长。

药物运输

由于EPS基质在生物膜相关疾病中对抗生素具有高抗性，因此在组织上生长的生物膜使感染更难以治疗。SERRS的应用还为跟踪生物膜基质中的药物运输提供了渠道，只要知道药物的共振波长即可。

凝集素LecA和LecB在铜绿假单胞菌生物膜中表现出不同的耐药性。共价凝集素抑制剂的研发可用于防止生物膜的形成，CLSM适用于凝集素成像和评估药物作用。同时，CLSM可以对纳米颗粒在生物膜中的渗透进行成像，并可用于跟踪生物膜中纳米药物的输送。因此，生物膜的可视化的变化为理解感染过程提供了依据，并因此研发了抑制凝集素，制定了基于纳米颗粒的抗生素载体来释放药物和杀死细菌的治疗策略。类似地，荧光探针也可能改变药物的释放行为。

TREC越来越多地用于对生物膜和单个微生物细胞（包括细菌和真菌）表面上的药物和抗体的分布进行成像分析。它可以定位细胞表面的药物受体，探测抗体 - 抗原的相互作用，同时评估药物对生物膜形态和粘附的影响。

细胞外电子转移

C型细胞色素和生物膜基质是微生物燃料细胞中细胞外电子转移的瞬时介质。C型细胞色素具有强共振拉曼信号，因此，RRS成像可用于研究产电微生物中的细胞外电子转移过程。此外，细胞外区域中细菌分泌的细胞可以帮助细胞外电子转移。量化生物膜中氟化物的产生和分布对于理解电子转移是有用的。MSI可以观察生物膜内核黄素的化学图谱，并为相关的电子转移提供直接证据。RRS，MSI和电化学工作站的组合可用于探索所涉及的分子机制和途径。

对环境压力的反应

生物膜中的细菌在环境压力下会分泌更多的EPS，特别是蛋白质，并形成紧密的结构来保护自身，而它们可以在营养匮乏的情况下通过产生细胞外酶以分解生物膜。对生物膜基质中的蛋白质组进行成像是MSI的强项，因此，它可用于识别应激蛋白和其他分子，以及它们的分布。该技术有助于理解生物膜微生物在环境胁迫下的适应机制。

SPRI可以观察生物膜表面的不同成分，包括单个细菌，细菌聚集体和EPS，这表明SPRI是监测生物膜中EPS生产动力学的有效工具。因此，SPRI的潜在应用是研究生物膜在环境压力下通过EPS生产的适应机制。此外，SPRI可以记录生物膜基质中的快速生化反应和细菌运动，因为它具有快速成像的能力。然而，SPRI无法识别EPS的特定组成部分。

结束语

成像技术可以对生物膜中的材料分布进行可视化，并提供生物膜基质中发生的微观过程的证据。在这里，我们介绍了七种成像模式的原理和应用，并进一步总结了每种方法在表征各种生物膜微观过程时的优势和局限性。然而，生物膜是水合的、不均匀的且具有一定的厚度。生物膜基质的组成和分布在脱水和切片后会发生变化。此外，荧光探针和纳米贵金属会干扰生物膜的微观过程或生物活性。因此，要在实际情况和综合生物膜中运用这些技术需要先解决这些问题（见未解决的问题）。另外，成像技术（例如，MSI和拉曼成像）中的一些用于获取和处理数据的方法需要进一步标准化或简化。这些发展将反过来为阐明生物膜微观过程提供更强大和合适的成像工具。

 术语表 

原子力显微镜（AFM）：一种表面分析方法，可通过样品表面和悬臂探针之间的相互作用来确定表面结构和性质。

细胞外电子转移：从微生物细胞中的氧化有机化合物释放的电子可以通过细胞内呼吸链转移到细胞外电子受体。

细胞外聚合物（EPS）：一种复杂的高分子量聚合物混合物，主要在某些环境条件下由微生物释放。它们主要含有蛋白质，多糖，DNA和脂质。

荧光原位杂交（FISH）：基于不同分类中已知微生物的特定DNA序列，使用荧光标记的寡核苷酸片段作为探针，通过与环境基因组中的r-RNA分子杂交，分析特定微生物种群的存在和密度水平。

m / z：质谱中使用的质荷比。

穿透深度：可通过分析技术检测的样品的垂直深度。

未培养的微生物：由于缺乏复制环境的条件和培养基质的方法，通过标准实验室方法难以培养的微生物。

最新工程应用和实践2019年第6期

本期所检索文献的发表时间范围：

2019年7月20日~2019年9月20日

《净水技术》SCI搬运工专刊特此汇编并转发，以期为国内同行相关检测和研究工作的开展提供技术支持。仅供分享交流不作商业用途，版权归原作者和原作者出处。

排版：西贝

校对：王佳、黎翔

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